Open Antibodies Project je globální výzkumná spolupráce společně podporovaná UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB a Addgene. Jeho cílem je řešit krizi reprodukovatelnosti protilátek prostřednictvím standardizace, transparentnosti a otevřeného sdílení. Jeho implementace není volná iniciativa, ale šesti{2}}krokový inženýrský proces, který je spustitelný, auditovatelný a reprodukovatelný.
1. Standardizované získávání a předkládání protilátkových genových sekvencí
Zdroj: Antigen-specifické B buňky jsou izolovány z imunizovaných zvířat nebo zotavených pacientů pomocí technologie třídění jednotlivých B buněk (jako je FACS). BCR mRNA je extrahována a amplifikována pomocí RT-PCR, aby se získaly kompletní V(D)J sekvence těžkého a lehkého řetězce.
Požadavky na formát: Sekvence musí být ve formátu FASTA a musí obsahovat anotace pro fragmenty genu V, D a J.
Musí být uvedeny informace o imunogenu (název antigenu, druh, postup imunizace).
Musí být uveden původ klonování (např. „lidský dárce č. 27, po infekci-SARS-CoV-2“).
Platforma pro odeslání: Odešlete nezpracovaná sekvenční data prostřednictvím formuláře „Navrhněte plazmid“ společnosti Addgene.
Klíčové body: Sekvence musí být gen rekombinantní protilátky; předložení nesekvenačních protilátek odvozených z hybridomů je zakázáno.
2. Konstrukce plazmidu a sestava konstruovaného expresního vektoru
Selekce vektoru: Použijte standardní savčí expresní vektory (např. pCMV nebo pEFl), zajišťující zahrnutí IgG1 Fc konstantní oblasti a Kozakovy sekvence.
Metoda klonování: Použijte sestavu Gibson nebo klonování Golden Gate k dosažení přirozeného párování těžkých a lehkých řetězců a vyhněte se náhodným kombinacím.
Konvence pojmenování plazmidů:
OpenAb_[Antigen]_[Druh]_[CloneID]_v1
Příklad: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Odeslání a kontrola prostřednictvím platformy Addgene
Podání příspěvku: Otevřete formulář Addgene Navrhněte plazmid
Kritéria revize: Sekvence bez kontaminace a mutací posunu rámce; Plazmid obsahuje kompletní promotor a terminátor; Poskytněte mapu plazmidu (soubor .gb)
Doba kontroly: Obvykle 7–14 pracovních dnů. Po schválení je přiděleno Addgene ID (např. #123456) a plazmid je veřejně přidán do databáze.
Výsledek: Plazmid se stává globálně prohledávatelným zdrojem, který je zdarma dostupný každému výzkumníkovi.
4. Standardizované generování a nahrávání ověřovacích dat
Metody validace: Musí být v souladu s pěti pilíři IWGAV (Mezinárodní pracovní skupina pro validaci protilátek):
|
Typ ověření |
Metoda |
Požadavky |
|
Genetická validace |
CRISPR knockout/knockdown cílového proteinu |
Zmizení nebo výrazné snížení WB pásem |
|
Ortogonální ověření |
Srovnání s hmotnostní spektrometrií nebo výsledky RNA-seq |
Konzistentní výrazový vzor |
|
Nezávislá validace protilátek |
Křížová{0}validace pomocí protilátek s různými epitopy |
Konzistentní výsledky |
|
Funkční ověření |
Neutralizační test, průtoková cytometrie |
Prokazuje očekávanou biologickou funkci |
|
Validace aplikace |
IHC, IF, WB, FC |
Specifické barvení pro cílovou aplikaci |
Formát dat:
IHC/IF snímky: Musí obsahovat negativní kontrolu (knokautální tkáň) a pozitivní kontrolu.
Obrázky WB: Musí obsahovat markery molekulové hmotnosti a vnitřní kontroly (např. -aktin).
Všechny obrázky musí být nahrány v bezztrátovém formátu TIFF spolu s experimentálními parametry (poměr ředění protilátek, doba expozice).
Povinný požadavek: Všechna validační data musí být publikována ve spojení s plazmidy; ani jedno není postradatelné.
5. Globální bezplatná distribuce a používání
Metoda přístupu:
Navštivte Addgene Antibody Plasmid Collection
Vyhledejte cílovou protilátku (např. "OpenAb_SARS2_Spike")
Odešlete smlouvu o ne-komerčním použití (není vyžadována žádná platba)
Příjem plazmidu (obvykle 5–10 pracovních dní)
Pokyny k použití:
V článku musí být citováno ID Addgene a původní zdroj sekvence.
Podpořte odesílání nových ověřovacích dat zpět do Addgene, aby se vytvořil uzavřený-ekosystém.
6. Kontinuální zpětná vazba a iterace ekosystémů
Mechanismus zpětné vazby dat: Uživatelé nahrávají nové experimentální výsledky (např. nové aplikace, reaktivita nových druhů) na platformu Addgene a vytvářejí dynamickou ověřovací databázi.
Správa komunity: DSHB a NIH pravidelně publikují zprávy o kvalitě protilátek, které eliminují neúčinné nebo zkříženě{0}}reaktivní protilátky.
Výsledky: Od roku 2025 lze nezávisle reprodukovat 89 % výzkumu využívajícího protilátky s otevřeným{2}}zdrojem, což daleko překračuje 45 % u komerčních protilátek.
